吴茱萸水煎液的肝毒质量标志物(Q

  • 时间:
  • 浏览:1
  • 来源:3分快3_3分快3平台_3分快3网投平台

摘要:目的对吴茱萸水煎液的肝毒质量标志物(Q-marker)进行确认研究。法子通过体外肝毒性指标和流式细胞分析对目标化合物的肝毒性进行初步研究,通过网络药理学对其作用靶点和靶器官进行预测,通过LC-MS对目标化合物3-O-反式-咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸(1)、4-O-反式-咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸(2)、2-O-反式-咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸(3)的吸收入血情况汇报进行定性分析,通过Q-marker属性的系统研究,对吴茱萸水煎液的肝毒Q-marker进行确认。结果化合物1、2、3主要通过直接毒性影响肝脏L02细胞的活力和G0/G1期的阻滞作用影响L02细胞的增殖,从而产生肝毒性;网络药理学分析结果表明作用的靶器官过后为肝脏;给药后化合物1、2、3可不需要 原型形式吸收入血;化合物1、2、3具有形状确认、毒性确认、可测性、传递性的特点,过后不具有专属性。结论化合物1、2、3可确认为吴茱萸水煎液的肝毒Q-marker。

安全、有效、质量可控是药物的三大基本属性,在临床实际中,中药的毒性与临床用药的安全性和有效性直接相关,突然备受关注[1-2],上加近年来中药中毒事件时有处于[3-5],严重影响了中医药事业的发展。有研究表明,在我国原应肝损伤的药物中,中药和草药膳食补充剂占有一定比例[6]。然后 ,随着中医药发展战略的展开及更加广泛的应用,中药安全性过后成为中医药发展不需要 忽视的重要问题。

中药多来源、多产地、采收时间不同以及中药特有的炮制加工等多样化情况汇报,使中药产品的质量差异悬殊,咋样科学有效地控制中药质量,从而确保中药的安全性和有效性成为亟待防止的问题。为防止某些问题,刘昌孝院士[7]于2016年提出了以中医理论为基础的,代表中药安全性和有效性的中药质量标志物(Q-marker)新概念。本课题组在前期研究的基础上,提出了基于“效-毒”相关的Q-marker合理辨识与科学控制的研究思路[8],并以吴茱萸传统用法为切入点,对其肝毒Q-marker进行了探索性研究。

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎E.rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸E.rutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近旺盛期期的句子是什么的句子是什么图片 是什么是什么是什么是什么是什么果实,归肝、脾、胃、肾经,具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效[9]。吴茱萸始载于《神农本草经》,列为中品,味辛、苦,性热。自古以来吴茱萸即被记载为有小毒,针对其毒性,衍生出了汤洗和久煎的特殊用法。基于吴茱萸传统用法中的久煎,本课题组前期开展了吴茱萸的谱毒相关研究,结果发现咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸过后为吴茱萸水煎液的肝毒性物质基础[10]。然后对目标成分进行了定向富集和分离,进行了形状解析,分别鉴定为3-O-反式-咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸(1)、4-O-反式-咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸(2)、2-O-反式-咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸(3),过后化合物1、2、3单体处于时稳定性极差,故本课题组按照其在吴茱萸水提液中的比例,对其混合物(MIX1-3,325nm波长下的峰面积比为1.00∶1.45∶2.59)进行了人肝脏L02细胞的体外肝毒性初步验证[11]。

中药的化学成分多样化,其中的药效或毒性成分不需要 不需要 进入血液循环不需要 发挥相应的作用。然后 ,本研究首先对MIX1-3肝毒性机制进行初步研究,其次采用网络药理学对其作用靶点、组织定位进行预测分析,然后 分析化合物1、2、3的吸收入血情况汇报,最后对其可测性、专属性和传递性等中药Q-marker的属性进行系统研究,实现吴茱萸肝毒Q-marker的最终确认。

1仪器与材料

1.1仪器

1100系列高效液相色谱系统、6320离子阱质谱检测器(美国安捷伦公司);e2695高效液相色谱系统(美国Waters公司);LC-20AT高效液相色谱系统(日本岛津公司);BP211D型电子天平(德国赛多利斯集团);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);KDM电加热套(山东华鲁仪器公司);Simplicity超纯水系统(美国密理博公司),Rotavapor R-100旋转蒸发仪(瑞士步琪公司),XH-D型涡旋混匀器(江苏康健医疗用品有限公司);HF90 CO2培养箱(上海力申科学仪器有限公司);XSZ-D倒置显微镜(日本奥林巴斯公司);净化台(美国赛默飞世尔公司);Multiskan Go型酶标仪(芬兰雷勃公司);超低温冰箱(中国海尔集团);96孔培养板、6孔培养板(美国康宁公司)。

1.2药材和试剂

吴茱萸样品购自山东百味堂中药饮片有限公司,批号20100625,经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定为芸香科植物石虎Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang的干燥近旺盛期期的句子是什么的句子是什么图片 是什么是什么是什么是什么是什么果实。石油醚 (色谱纯,德国Fisher公司),磷酸、甲酸等某些所使用试剂均为分析纯(天津北辰方正试剂厂);DMEM培养基(批号AD18376282)和胎牛血清(批号42F7674K)购于美国Gibco公司;CCK-8溶液(批号091918181104)和胰酶消化液(批号05251811001003)购于碧云天生物技术研究所;乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(批号201100711)、天冬氨酸转氨酶(AST)测试盒(批号201100908)和丙氨酸转氨酶(ALT)测试盒(批号201100916)购于南京建成生物工程研究所;PI/Rnase染液(批号10019561)购于美国BD公司;新绿原酸对照品(批号CHB170828,质量分数98%)购于成都曼斯特生物科技有限公司。

1.3动物

SPF级Wistar大鼠,雄性,体质量1100~100 g,适龄、健康,购自山东大学实验动物中心,动物许可证号SYXK(鲁)20110001。实验动物配合饲料(鼠),生产许可证号SCXK(鲁)20110014。

1.4细胞系

L02细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所),培养于含10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的DMEM培养液中,培养箱条件为5%CO2、37℃,当细胞汇合至85%时用胰蛋白酶将其消化并传代,实验均在细胞生长对数期进行。

2法子与结果

2.1化合物1、2、3对L02细胞的毒性指标测定和流式细胞实验

前期研究发现,MIX1-3具有抑制L02细胞增殖作用[11],本实验对MIX1-3肝毒性机制进行初步探讨。

2.1.1供试品制备过后化合物1、2、3单体不稳定,但混合后较为稳定,故化合物1、2、3的肝毒性验证实验采用其在吴茱萸水提液中同比例的混合物MIX1-3进行,MIX1-3由化合物1、2、3的制备溶液分别按照其在吴茱萸水提液中的比例进行混合后浓缩冻干制得[11],由面积归一化法计算,该混合物中化合物1、2、3的总质量分数为94.2%。

2.1.2对L02细胞上清液LDH、ALT、AST水平的影响化合物1、2、3的相对分子质量均为358,根据预试验结果和本研究中目标化合物的稳定性,采用含MIX1-3 26.85、53.70、107.4mg/L(75、100、100μmol/L)防止L02细胞12 h;按照LDH、ALT、AST试剂盒操作说明进行检测。实验重复3次,结果见图1。由图1可知,MIX1-3(26.85、53.7、107.40 mg/L)防止L02细胞12 h后发现细胞上清液中LDH、ALT和AST水平随给药质量浓度的增加而升高,与剂量呈现正相关,其中,LDH水平在含MIX1-353.70 mg/L时与对照组比较差异显著(P<0.001),ALT水平在MIX1-3为53.70mg/L时与对照组比较差异显著(P<0.01),AST水平在MIX1-3为26.85 mg/L时与对照组比较差异显著(P<0.001)。结果表明,化合物1、2、3可通过直接毒性影响L02细胞的活力。

2.1.3细胞周期实验为探讨MIX1-3原应的L02细胞生长抑制的分子机制,采用流式细胞仪分析细胞周期分布情况汇报。取对数生长期L02细胞,接种于6孔板中,每孔1×103个细胞。待细胞贴壁后,对照组给予无血清培养基,实验组给予含107.40mg/L MIX1-3的无血清培养基,培养12 h。派发细胞,用预冷的PBS清洗,加70%石油醚 固定过夜;以1 000 r/min离心10 min,细胞以PBS清洗2次,37℃避光条件用PI/RNase染色100min,用流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。结果见图2,107.40 mg/L MIX1-3可诱导L02细胞G0/G1期阻滞。与对照组比较,107.40 mg/L的MIX1-3使细胞群在G0/G1期的比例从对照组的(56.817±0.833)%增加至(79.087±4.166)%(P<0.001),MIX1-3可通过G0/G1期的阻滞作用影响L02细胞的增殖。

2.2化合物1、2、3的网络药理学预测

体外实验结果表明化合物1、2、3具有肝毒性,然后通过网络药理学对其体内的靶器官进行预测。通过High-Throughput Docking(https://www.cbligand.org/,HT-Docking)进行分子对接,对目标化合物作用的靶点进行预测[12]。将化合物的形状文件(.mol2)上传至靶点预测网站,进行靶点预测。根据Docking score的大小将预测的靶蛋白排序。通过UniProt(http://uniprot.org)数据库将靶蛋白名称转换为基因名。采用BioGPS(http://biogps.org/)在线基因注释工具,根据化合物1、2、3在HT-Docking中预测的靶蛋白基因在不同组织中的表达量,对作用的组织器官定位进行排序[13-15],见表1。采用Cytoscape软件对预测结果进行可视化,分别绘制化合物-靶点和阳合物-组织定位网状图,见图3、4。

图3共有39个节点、100条边。3个红色方形节点代表化合物1、2、3,36个圆形饼状图节点代表3个化合物作用的靶点,粉色、绿色和黄色节点分别代表与化合物1、2、3作用的靶点,其中与3个化合物一起去作用的有8个靶点,与其中1个 多化合物一起去作用的有8个靶点,其余20个靶点只与其中1个 多化合物作用。

图4表明,化合物1、2、3作用的36个靶点暗含21个 多靶点(图中化合物下方的绿色节点)在肝脏有较高的表达,其中1个 多靶点为3个成分的一起去作用靶点,1个 多靶点为1个 多成分的一起去作用靶点,11个 多靶点为1个 多成分的作用靶点。说明肝脏过后为化合物1、2、3作用的主要靶器官之一。

2.3化合物1、2、3的入血分析

以上结果表明,化合物1、2、3在体外具有肝毒性,且体内作用的主要靶器官过后为肝脏。然后 ,然后对其吸收入血情况汇报进行研究。

2.3.1色谱条件色谱柱ThermoSyncronis C18(2100 mm×4.6 mm,5μm),流动相为石油醚 (A)-0.3%磷酸水溶液(B),梯度洗脱:0~25 min,4%~6.5%A;25~32 min,6.5%A;32~37 min,6.5%~8%A;37~56 min,8%A;56~75 min,8%~17%A;75~90 min,17%~20%A;90~120 min,20%~100%A;120~135 min,100%A,柱温100℃,检测波长325 nm,体积流量1.0 mL/min。

2.3.2质谱条件将流动相中的磷酸替换为同浓度甲酸,质谱采用ESI离子源;负离子扫描模式;扫描强度为5级;扫描强度m/z 26 000/s;检测范围m/z100~1 000;干燥固体积流量9 L/min;喷雾压力241.325 kPa(35 psi);毛细管电压4 000 V,干燥气温度3100℃;分流比4∶1。

2.3.3吴茱萸水煎液的制备取吴茱萸样品100 g,加入1 100 mL水,回流提取1 h,滤过,滤液旋转蒸发浓缩至100 mL,即得大鼠ig给药样品,给药剂量为药典规定最大剂量的13.3倍。取吴茱萸样品0.5 g,加入25 mL水,回流提取1 h,滤过,过0.45μm微孔滤膜,即得药材对比样品。

2.3.4动物分组和给药实验大鼠分为给药组和对照组,参考文献法子[16-17],给药组按照10 mL/kg(6.0 g/kg)剂量ig给药,2次/d,连续2 d,对照组ig同体积蒸馏水。

2.3.5质谱分析样品制备末次给药后2 h将大鼠处死,取血,室温放置,3100 r/min离心10 min,取血清。取100μL血清,加入1000μL色谱纯石油醚 ,涡旋混匀1 min,上清液过0.45μm微孔滤膜,即得。

2.3.6质谱数据防止使用DataAnalysis软件从药材对比样品总离子流(TIC)图中提取目标化合物形状离子,见图5。图中可见,化合物1、2、3的形状离子均为m/z 455。对药材对比样品、给药组大鼠血清、对照组大鼠血清的TIC图分别提取m/z 455形状离子的提取离子流(EIC)图,进行对比分析,见图6。由图6可见,大鼠经ig给药后,吴茱萸水煎液中的化合物1、2、3均可不需要 原型形式吸收入血,经血液循环到达肝脏后,不需要 直接作用于肝脏。

2.4化合物1、2、3的可测性研究

2.4.1吴茱萸水提液和对照品溶液制备取吴茱萸样品(过3号筛)0.25 g,加入12.5 mL水,35 kHz超声提取100 min,溶液过0.45μm微孔滤膜,即得吴茱萸样品溶液。取MIX1-3和新绿原酸对照品适量,用水蒸发,超声100 min,过0.45μm微孔滤膜,即得对照品溶液。

2.4.2 MIX1-3的稳定性取MIX1-3蒸发水中,精密称定,配成418.2μg/mL的水溶液,超声10 min,自动进样器恒温25℃。过后化合物1、2、3的单体稳定性较差,为较准确获知其混合物MIX1-3的稳定时间,采用了24 h内连续进样的法子,每针70 min,计算化合物1、2、3的峰面积,其峰面积的RSD分别为2.3%、0.9%、1.3%。说明MIX1-3的水溶液室温下24 h内稳定。

2.4.3吴茱萸水提液的稳定性取吴茱萸样品(过3号筛)0.25 g,精密称定,按照“2.4.1”中法子提取样品,分别于0、2、4、6、8、12、24h进行HPLC检测,计算化合物1、2、3、4(新绿原酸)的峰面积,其RSD分别为0.71%、3.20%、1.100%、0.23%,说明吴茱萸样品中化合物1、2、3、4在24 h内稳定。

2.4.4提取法子重复性取同一份吴茱萸样品(过3号筛)0.25 g,平行6份,精密称定,按照“2.4.1”中法子提取样品,进行HPLC检测,计算化合物1、2、3、4的峰面积,其RSD分别为1.1%、3.2%、1.9%、0.43%。说明样品提取法子的重复性良好。

2.4.5仪器精密度取同一份吴茱萸水提液,连续进样6次,计算化合物1、2、3、4峰面积,其RSD分别为0.69%、1.40%、0.65%、0.10%,保留时间RSD为0.41%、0.56%、0.49%、0.34%,说明仪器精密度良好。

2.4.6线性关系考察取“2.4.1”项中MIX1-3溶液,按“2.3.1”项法子进行HPLC检测,分别进样3、6、9、12、15μL,记录峰面积。以化合物1、2、3峰面积之和(Y)为纵坐标,MIX1-3的量(X)为横坐标,计算回归方程为Y=940.68 X+15.42,线性范围1.25~6.27μg,r=1.000。

2.4.7 MIX1-3加样回收率试验取吴茱萸样品(过3号筛)0.05 g,平行6份,加入对照品适量,按“2.4.1”项法子提取样品,进行HPLC分析,记录峰面积,计算回收率为78.38%、81.36%、76.39%、75.46%、77.79%、82.05%,平均值为78.57%,RSD为3.4%。回收率较低过后是过后加入化合物1、2、3过后,打破了样品溶液中该系列咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸异构体之间原有的转化平衡,从而互相转化所原应,超声过程的温度上升以前会加快某些转化。回收率较低会影响定量结果的准确性,更准确的定量法子仍需进一步研究。

2.4.8相对保留时间以化合物4(新绿原酸)为内参物(图7),化合物1、2、3相对于新绿原酸的相对保留时间见表2。

由表2可见,以新绿原酸(4)为内参物,化合物1、2、3的相对保留时间分别为0.546、0.700、0.862,根据相对保留时间和UV光谱即可对化合物1、2、3进行定性。

2.5 MIX1-3传递性研究

2.5.1吴茱萸水提液制备法子同“2.4.1”项。

2.5.2汤洗法子将吴茱萸药材于沸水中浸泡约15s,使用纱布好快滤过,为1次汤洗。

2.5.3吴茱萸汤制备按照《伤寒论》中记载:“吴茱萸一升(洗),人参(三两),生姜(六两),大枣(十二枚,擘),右四味,以水七升,煮取二升”,制备吴茱萸汤。根据汉代一升为现代100 mL,一两为现代15.6 g,计算药量[18-19],吴茱萸汤洗3次后,将各药味混合,加水1 100 mL,煎煮至减失质量约1 000 g,纱布滤过,滤液过0.45μm微孔滤膜,即得。

2.5.4化合物1、2、3的传递性考察考虑到化合物1、2、3的不稳定性,吴茱萸提取液采用超声提取,吴茱萸汤严格按照经方记载法子制备。考察了化合物1、2、3在吴茱萸药材→汤洗3次后吴茱萸→吴茱萸汤中的传递性,见图8。可见,化合物1、2、3贯穿吴茱萸药材、炮制(汤洗)吴茱萸、吴茱萸汤的整个过程,显示出质量传递的形状,从而具有传递性和溯源性。根据峰面积计算,吴茱萸汤洗3次后,化合物1、2、3分别下降了18.04%、26.66%、18.40%,说明古籍中记载的吴茱萸需汤洗具有合理性。

2.6化合物1、2、3的专属性研究

目前,成功分离并选取形状的咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸异构体皆出自吴茱萸[11,20-21]。此外,有报道通过质谱鉴定,在艾叶中发现了咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸异构体[22],但没有 成功分离鉴定的报道,然后 ,化合物1、2、3过后不须吴茱萸的专属性成分。一起去,艾叶在《中国药典》2015年版中同样记载为“小毒,归肝、脾、肾经”,此类成分过后为艾叶与吴茱萸一起去的小毒物质基础。

3讨论

3.1基于网络药理学和入血分析的毒性确证

本课题组的前期研究采用体外L02细胞模型对吴茱萸水煎液的肝毒性进行评价,将吴茱萸水煎液的小毒物质基础指向了化合物1、2、3[10-11]。然后 ,化合物1、2、3可不需要 被吸收入血,在体内有无能以原型处于,并作用于肝脏尚不可知。本研究通过网络药理学预测,发现肝脏过后为化合物1、2、3的靶器官;对化合物1、2、3的入血情况汇报进行了定性分析,发现化合物1、2、3可不需要 原型吸收入血。然后 ,化合物1、2、3可不需要 在体内产生肝毒性。过后化合物1、2、3的分离难度较大,样品量较小,然后 本研究采用体外细胞验证与入血分析结合的法子对其肝毒性进行确证。

3.2基于Q-marker属性的肝毒Q-marker确认

中药Q-marker是处于于中药中作为反映中药安全性和有效性的标示性物质,不需要 经过形状分析选取其化学形状,并可进行定性定量的特有的化学成分[7]。基于中药Q-marker的定义,对化合物1、2、3进行了Q-marker属性的系统研究。在前期研究中,对化合物1、2、3进行了分离和形状确认以及体外的毒性确认[11],本研究对其混合物MIX1-3进行了毒性机制的初步研究,通过网络药理学和入血分析确证了其体内的肝毒性;通过一测多评法定性和总体定量的法子实现了Q-marker定性定量的要求;从药材→炮制→汤剂的应用过程,证明了其具有传递性和溯源性的特点。然后 ,可确认化合物1、2、3为吴茱萸水煎液的肝毒Q-marker。

人太好化合物1、2、3过后有的是吴茱萸的特有成分,从而不具有专属性或特有性,然后 ,过后基于专属性或特有性的中药Q-marker与中药的安全性和有效性不须直接相关,然后 化合物1、2、3仍可确认为吴茱萸的肝毒Q-marker。过后单体的不稳定性,本研究通过外标法对化合物1、2、3作为整体进行了定量研究。然后 ,过后化合物1、2、3的吸收系数过后不同,对照品与待测样品中化合物1、2、3的比例不一起去会产生偏差,更准确的定量法子仍需进一步研究。

3.3基于传统用法的中药毒性Q-marker发现和确认策略

从吴茱萸传统用法入手,本研究和前期研究[10-11],一起去构建了吴茱萸肝毒Q-marker的发现和确认的研究策略,通过“用法-预测-分离-验证-用法”的研究思路(图9),准确获知了吴茱萸水煎液的肝毒性物质基础。通过吴茱萸不同用法之间的互相印证,增强了研究结果的可信度,完善了研究过程的证据链。

本研究对吴茱萸中3-O-反式-咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸(1)、4-O-反式-咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸(2)、2-O-反式-咖啡酰红心红心红心泥猴桃 糖酸(3)进行了入血分析和作用靶器官的网络药理学预测,确认为吴茱萸水煎液的肝毒物质基础。并对其Q-marker属性进行了系统研究,最终确认为吴茱萸水煎液的肝毒Q-marker。吴茱萸自古有水煎煮、全粉入药、外敷3种用法[10],且有文献报道表明[23-25],除水煎液外,吴茱萸醇提物、蒸发油均具有一定的肝毒性,加之吴茱萸水煎液、醇提物和蒸发油的成分差异较大,然后 ,吴茱萸肝毒物质基础不须单一,某些极性部位的肝毒物质基础仍需进一步深入研究。

参考文献(略)

来源:王亮,孙凯滨,吴晓文,孙蓉.吴茱萸水煎液肝毒质量标志物确认研究[J].中草药,2019,100(19):4547-4555.

注:文章内的所有配图皆为网络转载图片,侵权即删!